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ヒトiPSから軟骨作製、関節治療に道

掲載日:2015年2月27日

ヒトの人工多能性幹細胞(iPS細胞)から関節の軟骨組織を作製するのに、京都大学iPS細胞研究所の山下晃弘(やました あきひろ)研究員、妻木範行(つまき のりゆき)教授らが初めて成功した。マウスやラット、ミニブタへの移植実験で、安全性と品質も検証した。事故や加齢で関節軟骨が損傷した患者への再生医療の一歩になる成果で、4年後にも臨床応用の開始を目指している。京都大学大学院医学研究科の松田秀一(まつだ しゅういち)教授らと共同研究で、2月26日付の米科学誌Stem Cell Reportsオンライン版に発表した。

関節軟骨は、腕や膝を曲げた時などにかかる衝撃を吸収する組織で、ガラス軟骨と呼ばれる。年を取ってすり減ったり、事故などで傷ついたりすると、ガラス軟骨が線維軟骨に変性して関節を滑らかに動かしにくくなる。治療法として、自分の健康な軟骨を採取して移植する方法が普及しているが、高品質で十分な量の軟骨細胞を確保することが難しく、移植部位に線維軟骨ができるなどの課題もあり、再生医療の確立が期待されている。

研究グループはまず、ヒトの皮膚や血液からiPS細胞を作り、軟骨細胞になった時にのみ緑色蛍光を発するようにした。そのiPS細胞から軟骨細胞を作製するための培養条件を検討した。軟骨へ分化させるには、培養液に3種類のタンパク質(BMP2、TGFβ1、GDF5)が必要なことを見つけた。iPS細胞が、培養皿の底に接着して分化を始めて14日後から、細胞を浮かんだ状態で培養した。

細胞自身が細胞外マトリックスを形成し、1、2カ月で次第に緑色に発光する軟骨組織塊を作りだせた。この方法では、直径3.5cmの培養皿1個当たり約15個の軟骨組織塊ができた。1個の軟骨組織塊は約7万個の軟骨細胞を含む。ヒトへの移植を考えると、1症例30~150個の軟骨組織塊が必要となる。これは培養皿2~10個分となり、実用的な規模という。

生体内で軟骨を生じる能力を測るため、ヒトiPS細胞から作製した軟骨組織塊を免疫不全マウスの皮下に移植した。その結果、品質の悪い線維軟骨ではなく、良質なガラス軟骨になることを確かめた。また、関節軟骨を損傷させた免疫不全ラットの患部に、ヒトiPS細胞からの軟骨組織塊を移植したところ、4週間後に移植塊が生着し、隣接する生体内の軟骨と癒合を始めた。マウス、ラットともに3カ月間は、がん化やがん転移がみられなかった。

ヒトへの移植治療法開発を念頭におく場合、移植された軟骨の品質を明らかにするには、体重が軽いマウスやラットだけでなく、より関節に荷重がかかる大型動物で確かめる必要がある。そこで、ヒトiPS細胞から作製した軟骨組織塊を、事前に免疫抑制剤を投与したミニブタ(体重30kg弱)の関節損傷部位へ移植した。移植後1カ月の時点で、移植した軟骨組織塊が患部に生着して体重を支え、近接する軟骨組織と融合しうる能力があった。

妻木範行教授は「ヒトiPS細胞から軟骨細胞への新しい分化方法を確立し、その軟骨から純粋なガラス軟骨が生体内で生じることを実証した。動物実験で、安全に関節軟骨の欠損を補うこともできた。今後、ヒトに使える試薬を用い、臨床用の細胞調整室でガラス軟骨を誘導できるように、分化方法を微調整する。さらに動物実験などを重ねて、安全性と有効性を十分確認する。培養何日目の軟骨が再生医療の移植に最も適しているかも検討して、ヒトへの臨床応用を目指したい」と話している。

ヒトiPS細胞からガラス軟骨組織を誘導するための培養方法。ヒトiPS細胞から軟骨細胞へ向けて分化誘導を始めてから3日後に3種類のタンパク質(BMP2、TGFβ、GDF5)を加えた培地で接着培養を行った。14日後からは浮遊培養に移した。日数が進むにつれ、緑色の蛍光を発して、軟骨細胞であることを示す細胞が増えてくる(上部の組み写真、スケールバー50μm)。56日後には1~2mmの大きさの軟骨組織塊が直径3.5cmの培養皿内にみられる(右上写真、スケールバー5mm)。
図1. ヒトiPS細胞からガラス軟骨組織を誘導するための培養方法。ヒトiPS細胞から軟骨細胞へ向けて分化誘導を始めてから3日後に3種類のタンパク質(BMP2、TGFβ、GDF5)を加えた培地で接着培養を行った。14日後からは浮遊培養に移した。日数が進むにつれ、緑色の蛍光を発して、軟骨細胞であることを示す細胞が増えてくる(上部の組み写真、スケールバー50μm)。56日後には1~2mmの大きさの軟骨組織塊が直径3.5cmの培養皿内にみられる(右上写真、スケールバー5mm)。

ミニブタの関節に移植した軟骨組織塊の生着を確認。関節を損傷させたミニブタに軟骨組織塊を移植し、1カ月後に関節組織を顕微鏡で観察した。矢印は生体内の軟骨と移植した軟骨組織塊との境界。右は左の顕微鏡写真の一部の拡大。スケールバーは左が500μm、右が50μm。
図2. ミニブタの関節に移植した軟骨組織塊の生着を確認。関節を損傷させたミニブタに軟骨組織塊を移植し、1カ月後に関節組織を顕微鏡で観察した。矢印は生体内の軟骨と移植した軟骨組織塊との境界。右は左の顕微鏡写真の一部の拡大。スケールバーは左が500μm、右が50μm。
(いずれも提供:妻木範行京都大学教授、Stem Cell Reportsの論文に掲載)
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